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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification
JoVE 3155 11/18/2011

特定ゲノム領域上の分子間相互作用解析に有用な3xFLAG-dCas9発現マウス


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特定ゲノム領域上の分子間相互作用解析に有用な
3xFLAG-dCas9発現マウス

C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-3XFLAG/dCas9,-EGFP)Hfuj> (RBRC10188)
C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1.1(CAG-3XFLAG/dCas9,-EGFP)Hfuj> (RBRC10189)
C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1.2(CAG-3XFLAG/dCas9)Hfuj> (RBRC10190)

MMfig_201910

Courtesy of Hodaka Fujii, M.D., Ph.D.

3xFLAG-dCas9発現カセットの構造と、3xFLAG-dCas9を発現するトランスジェニックマウスを用いたenChIP解析の概要

 

特定のゲノム領域にどういった分子が結合しているかを明らかにすることは、転写制御やエピジェネティック制御など、ゲノム配列情報だけではわからない、ゲノム機能発現調節機構の理解につながります。最近、遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降法 (enChIP法) と呼ばれる、ゲノム編集技術でも用いられる人工DNA結合分子を利用し、細胞内での構造を保持したまま分子間相互作用を解析可能な手法が開発されました[1,2]。

今回ご紹介する3xFLAG-dCas9発現マウスは、このenChIP法を、個体由来の細胞で実施する際に有用なノックインマウスです[3]。本系統は、ROSA26遺伝子座にトランスジーンが挿入されており、外因性のCAGプロモーター制御下で、エピトープタグが付いたDNA切断活性欠損型のStreptococcus pyogenes由来のCas9タンパク質 (3xFLAG-dCas9) を発現します。3xFLAG-dCas9発現マウスから初代培養細胞を単離し、標的とするゲノム領域に対するガイドRNA (gRNA) を発現させると、細胞内でgRNAは3xFLAG-dCas9と複合体を形成し、標的のゲノム領域に結合します。その後、3xFLAGタグを利用して標的のゲノム領域をアフィニティー精製によって単離し、結合している分子を解析します。質量分析法を用いれば、タンパク質を、次世代シークエンス法を用いれば、DNA・RNAを網羅的に同定可能です。

enChIP法を実現するためには、細胞内で3xFLAG-dCas9とgRNAとを発現させる必要があります。3xFLAG-dCas9発現マウス由来の細胞であれば、目的のgRNAだけを導入すれば良いので、遺伝子導入効率の低い細胞種に対しても、enChIP法を実施できる可能性があります。今後、enChIP法を用いた解析により、生命現象や疾患発症のメカニズムの解明にインパクトを与えるようなデータを得られることが期待されます。

 

Depositor : 藤井 穂高 先生
弘前大学大学院 医学研究科 ゲノム生化学講座
Strain name : C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-3XFLAG/dCas9,-EGFP)Hfuj>
(Cre/loxPシステム及びFlp/FRTシステムの利用により、3xFLAG-dCas9または蛍光レポーターを誘導的に発現)
RBRC No. : RBRC10188
Strain name : C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1.1(CAG-3XFLAG/dCas9,-EGFP)Hfuj>
(3xFLAG-dCas9及び蛍光レポーターを発現)
RBRC No. : RBRC10189
Strain name : C57BL/6-Gt(ROSA)26Sor<tm1.2(CAG-3XFLAG/dCas9)Hfuj>
(恒常的に3xFLAG-dCas9を発現)
RBRC No. : RBRC10190
References : [1] Fujita T, Fujii H.
Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.
Biochem Biophys Res Commun.; 439(1):132-6, 2013.
[2] Fujita T, Asano Y, Ohtsuka J, Takada Y, Saito K, Ohki R, Fujii H.
Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).
Sci Rep.; 3:3171, 2013.
[3] Fujita T, Kitaura F, Oji A, Tanigawa N, Yuno M, Ikawa M, Taniuchi I, Fujii H.
Transgenic mouse lines expressing the 3xFLAG-dCas9 protein for enChIP analysis.
Genes Cells.; 23(4):318-325, 2018.

 

October 2019
Saori Mizuno, Ph.D.
Contact: Experimental Animal Division, RIKEN BioResource Research Center (animal@brc.riken.jp)
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